Tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin phân lập từ ruột cá nhằm thay thế thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

Việc sử dụng kháng sinh được xem là phương pháp điều trị phổ biến và có hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc lạm dụng chất kháng sinh có thể dẫn tới tình trạng kháng thuốc của các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản đồng thời gây mất an toàn thực phẩm và ảnh hưởng lớn tới chất lượng nông sản. Do vậy việc nghiên cứu biện pháp phòng bệnh, hạn chế sử dụng chất kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản để đảm bảo năng suất và chất lượng nông sản hiện đang là vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm.

Bacteriocin có bản chất là các phân tử protein được tổng hợp ở ribosom của vi khuẩn, có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Một số loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Rattanachaikunsopon & cs, 2010). Bacteriocin không được coi là một nhóm kháng sinh vì chúng thể hiện phổ kháng khuẩn chống lại các chủng của các loài có quan hệ họ hàng gần; trong khi kháng sinh phát huy tác dụng ức chế đối với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh, ngay cả khi hoạt tính của kháng sinh bị hạn chế, nó không cho thấy bất kỳ tác dụng ưu tiên nào đối với các loài có họ hàng gần (Zacharof & Lovitt, 2012).

Hình 1. Bacteriocin hoạt động như một chất kháng sinh tự nhiên (Yang et al., 2014)

Các mẫu vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường MRS có bổ sung 0.5% CaCO₃. Đề tài đã phân lập được 16 mẫu vi khuẩn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn lactic như khuẩn lạc tròn, bóng, bìa nguyên hoặc bìa viền, có khả năng phân giải CaCO₃ theo mô tả của Kandler và Weiss (1986) từ 18 mẫu ruột cá Lăng, cá Trắm, cá Diêu Hồng, cá Rô Phi thu thập được từ các địa phương khác nhau: Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Nghệ An.
Các chủng vi khuẩn phân lập được đều cho thấy có khả năng phân giải CaCO₃ làm trong môi trường sau 1 ngày nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy càng lâu lượng acid lactic sinh ra nhiều sẽ hoàn toàn làm trong môi trường nuôi cấy làm môi trường chuyển từ đục sang trong (Hình 2) và các chủng phân lập được đều là vi khuẩn gram dương với 07 chủng là cầu khuẩn và 09 chủng là trực khuẩn (Hình 3). 
     

Hình 2. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường MRS có bổ sung 0.5% CaCO₃

 

HN1	NA1.3	HP1.1

Hình 3. Hình thái tế bào của một số chủng vi khuân phân lập quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập được kiểm tra khả năng ức chế sinh trưởng đối với hai chủng vi sinh vật kiểm định là Salmonella sp. và Escherichia coli bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Trong tổng số 16 chủng vi khuẩn phân lập được thì có 9 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với hai chủng vi khuẩn kiểm định (hình 4). Trong đó chủng HN1 cho thấy khả năng kháng mạnh đồng thời với cả hai chủng vi khuẩn kiểm định với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 16 mm (salmonella sp.) và 15 mm (Escherichia coli) (hình 5).

Hình 4. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn đối với các chủng vi khuẩn kiểm định

Hình 5. Khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đối với các chủng vi khuẩn kiểm định
        Trong số 08 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, chủng HN1 và chủng NA1.3 có khả năng sinh bacteriocin và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đồng thời với cả hai chủng vi khuẩn kiểm định là mạnh nhất được tuyển chọn để định danh. Sản phẩm PCR của 16S rRNA được tinh sạch và giải trình tự tại công ty 1st BASE (Singapore). Sau đó trình tự gen của các chủng tuyển chọn được tiến hành so sánh với các trình tự khác đã được công bố trên ngân hàng gen nhờ công cụ blast, xây dựng cây phân loại cho chủng HN1 và chủng NA1.3 bằng phần mềm MEGAX.
   
Hình 6. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA của chủng vi khuẩn HN1 (a) và chủng NA1.3 (b)
Kết quả cây phân loại (hình 6) cho thấy chủng vi khuẩn HN1 cùng nhánh với chủng Enterococcus faecium DSM 20477 với giá trị bootstap là 95, chủng NA1.3 cùng nhánh với chủng Enterococcus faecalis NBRC 100481 với giá trị boostrap là 94. Bên cạnh đó kết quả căn trình tự nucleotide cho thấy mức độ tương đồng của 16S rRNA của chủng vi khuẩn HN1 với Enterococcus faecium DSM 20477 là 99.91% và chủng NA1.3 với Enterococcus faecalis NBRC 100481 là 99.72%. Xét về giá trị tin cậy và mức độ tương đồng thì chủng HN1 với chủng Enterococcus faecium DSM 20477 là giống nhau, chủng NA1.3 với chủng Enterococcus faecalis NBRC 100481 là giống nhau. . Đồng thời, nghiên cứu cũng đã xác định được điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để chủng Enterococcus faecium HN1 và Enterococcus faecalis NA1.3 sinh bacteriocin tốt nhất là môi trường MRS lỏng có bổ sung glucose và yeast extract với tỉ lệ 3%.